Cześć, z tej strony Michał z kanału

Magobiologia. Witam was bardzo

serdecznie w następnym odcinku

poświęconym olimpiadzie. Dzisiaj zrobimy

sobie pracownię bioinformatyczną 54

olimpiady biologicznej. Zapraszam do

oglądania. Na początku wstęp. No

przeczytajmy sobie go. Rozwiązując

zadania możemy korzystać z wymienionego

poniżej oprogramowania. Ape, czyli już

legendarny program z olimpiady

biologicznej, domyślne składniki systemu

operacyjnego, kalkulator, notatnik i w

każdym zadaniu samodzielnie wybieramy

program lub programy. Metoda rozwiązania

nie będzie oceniana,

liczy się wyłącznie końcowy wynik i

odpowiedzi zapisujemy w pliku odpowiedzi

txt. Ja tego nie będę robił. Yyy, ten

plik w takiej formie jak powinien być.

Treść tego pliku znajdziecie w opisie

yyy tego filmu.

Y więc tutaj mamy jeszcze wskazówki jak

ten plik uzupełniać. Nie zmieniamy

nazwy, nie dodajemy dodatkowych wierszy.

To nas nie interesuje. Nas interesuje

część merytoryczna

tej olimpiady. No i mamy katalog

sekwencje, w którym znajdują się cztery

sekwencje. Ja ten katalog już pobrałem.

również możecie go pobrać z strony

olimpiady biologicznej. No i mamy plik

pierwszy NC012920

GB format Ginbank. To jest całkowita

sekwencja nukleotydytowa

mitochondrialnego DNA Homo Sapiens.

Format Ginbank różni się od formatu

fasta, który jest formatem wyłącznie

przechowującym sekwencje, że zawiera

również informacje o tym, co ta

sekwencja koduje.

NG to następny plik. Tutaj to G będzie

sugerowało nam, żeby mamy do czynienia z

sekwencją genu

i nm sekwencja dojrzałego mRNA

kodującego białko TRM5.

M, czyli mamy gen i mRNA tego samego

białka. No i mamy PUC18

Fastę, sekwencję nukleotydową wektora

PUC18 właśnie. No i sekwencja mRNA

zawiera tym zamiast uracylu ze względu

na konwencję przyjętą do zapisywania

sekwencji nukleotydowych stosowaną w

analizach bioinformatycznych. Tak

bioinformatycy właśnie robią, że nie

przejmują się tym, że w rzeczywistości

jest inaczej. Zapisujemy wszystko jak

DNA. I mamy jeszcze załącznik pierwszy,

w której umieszczono tabelę z

aktywnością enzymów restrykcyjnych w

zależności od buforu AD, w którym

zachodzi reakcja.

ten załącznik za chwilę w którymś tam

zadaniu z tego co pamiętam zobaczymy. No

dobra, no to mamy wstęp teraz też

teoretyczny. Enzym TRM5 występujący u

ludzi katalizuje reakcję metylacji

guaniny w pozycji 37 w różnych trna.

Wykazano, że substratem reakcji

metylacji jest mitochondrialny TRNA

przenoszący prolinę. Do badania

aktywności enzymatycznej TRM5 jest

niezbędna produkcja TRNa prolinowego

Invitro. Matrycą do transkrypcji invitro

jest wektor przenoszący zawierający,

przepraszam dwa elementy. Promotor dla

polimerazy RNA z faga T7 oraz sekwencje

genu prolinowego.

Konstruk genetyczny będzie oparty na

wektorze PUC18, którego miejsce

ułatwiające klonowanie zostało

przedstawione poniżej. Czyli będziemy

mieć zarówno promotor dla polimerazy

RNA, a zaraz po nim, po tym promotorze

będziemy chcieli wkleić sekwencję genu

pro, żeby po prostu zachodziła

ekspresja.

no właśnie tego genu i żeby powstawało

nam TRNA Pro,

żeby zbadać aktywność enzymatyczną TRM5,

który

metyluje właśnie to TRN na PR. Tutaj

było to napisane. I mamy również

miejsca, które będą nas interesowały,

miejsca restrykcyjne w tym wektorze

PUC18.

Widzimy, mamy Hint 3, PST1, BAMH1, KPN1

i Eco R1. Yyy, wszystkie mają z tego co

widzę sześć nukleotydów długości. Yyy,

ale też będziemy więcej o tych enzymach

wiedzieć z załącznika 1, który gdzieś to

na następnych zadaniach się yyy pojawi.

Zamówiono syntezę dwóch

oligonukleotydów, które zostaną

zmieszane w równym stosunku molowym,

podgrzane do 95 stopni Celjusza, a

następnie powoli schłodzone do

temperatury pokojowej. Poddane

hybrydyzacji oligonukleotydy będą

promotorem T7 i zostaną wprowadzone do

wektora PUC18 uprzednio strawionego

enzymami restrykcyjnymi hint 3 i PST1.

To bardzo ważne, należy to podkreślić.

Hint 3 i PST1 będą tymi enzymami,

którymi będziemy przecinać nasz plazmit

PUC18.

I teraz nie wiem czy tutaj wiecie o co

chodzi. To znaczy y zamiast mieć od razu

wstawkę y którą wstawimy w ten plazmit

po przecięciu go hint 3 i pst1, my

zamawiamy jeden nukleotyt,

oligonukleotydyt z tej wstawki, drugi

oligonukleotyt, one tworzą strukturę

dwuniciową i tą strukturę dwuniciową

dopiero wstawiamy w to miejsce, które

zostało przecięte tymi enzymami hint.

Yyy, więc tutaj tak się po prostu

eksperyment yyy

prezentuje.

No i mamy zadanie 11. Yyy, który bufor

wybrać? Przepraszam za tą literówkę w

pod tytule. Mamy załącznik pierwszy,

mamy nazwę enzymu, sekwencję 5 prim, 3

prim, aktywność w stosunku do aktywności

maksymalnej w różnych buforach, tychże

enzymów. I mamy jeszcze oznaczenie z

gwiazdką. świadczy o niespecyficznej

aktywności enzymu restrykcyjnego

względem rozpoznawanej przecinaniaj

sekwencji nukleotydowej.

I oznaczenie taki desz określa miejsce

przecięcia DNA w obrębie rozpoznawanej

przez enzym restrykcyjny palindromicznej

sekwencji nukleotydowej. Tak, czyli BAM

H1 tnie w ten sposób, Eco R1 tutaj też

hint 3 w ten sposób KPN1 bardzo podobnie

tylko przy końcu 3 prim tych sekwencji i

PST1 również przy końcu 3 prim. tych

sekwencji. Pamiętajmy, że z tego co

wiemy z poprzedniego

wstępu do zadania, ale także z tego

zadania 1. będziemy przecinać

nasz wektor PUC18 enzymami hint 3 i

PST1. Tak? I teraz w zadaniu 1. mamy

określić bufor, w którym jednoczesne

trawienie wektora PłC18 tymi enzymami

zachodzi najwydajniej. Y, no i w

odpowiednie miejsce w tym pliku mamy

wpisać odpowiednie oznaczenie literowe

buforu A, B, C lub D. No więc zobaczmy

sobie te bufory. Mamy bufor A, patrzymy

na hint PST1, suma wynosi około 100.

Bufor B 100 + 75 175

100 150, więc gorzej niż bufor B. No i

bufor D zupełnie słabo, no bo mamy 100,

ale tutaj też mamy niespecyficzną

aktywność tego enzymu restrykcyjnego,

więc wybieramy bufor B i to jest

odpowiedź do tego zadania. Bardzo proste

zadanie na początek. Natomiast zadanie

drugie jest według mnie najtrudniejsze z

całego z całego arkusza.

Mamy podać sekwencję

drugiego oligonukleotydu, które zostało

zamówiony, czyli tego, który mówiłem

składa się z tym pierwszym.

Całe szczęście mamy zamówiony jeden z

oligonukleotydów i mamy sekwencję podaną

tego oligonukleotydu.

Tutaj widzimy jego sekwencję od 5 do 3

prim i podkreślono tę część sekwencji,

która stanowi promotor T7, czyli ta

część T a i tak dalej do tata to jest

promotor T7. Natomiast tutaj mamy jakieś

takie overhangi, tak to się mówi na to,

że one tak poza tą częścią kluczową tego

oligonukleotydu, one jeszcze tak wiszą.

Dobra. No i teraz mamy podać sekwencję

drugiego oligonukleotydu, który został

zamówiony. Sekwencję mamy wpisać w

orientacji 5 prim 3 prim. O tym bardzo

trzeba pamiętać.

W plik y odpowiedzi txt. No i wyłącznie

stosujemy ACG lub t. I teraz tak,

zrobimy to też w apie, ale chciałbym,

żebyśmy na razie to zrobili na kartce,

bo to się wam może przydać do myślenia o

tych, o te takim typie zadań, jeśli

pojawi się podobne w tym lub w

przyszłych latach na olimpiadzie.

Mamy enzymy, które mamy enzymy Hint 3 i

PST1. Wiemy jak one tną i wiemy też jak

wygląda sekwencja tutaj w ich pobliżu w

tym plazmidzie.

Dobra. No i teraz tak. Plazmid przed

strawieniem. Tutaj jest przepisana ta

sekwencja,

która występuje tutaj.

Tylko troszeczkę dodałem jeszcze od

siebie, to znaczy dopisałem po prostu

drugą nić.

Mamy miejsce rozpoznawane przez hint 3.

Mamy miejsce rozpoznawane przez PST1. No

i teraz przecinamy hint 3 i pst 1.

Powstają nam zgodnie z tymi wzorcami.

Hint 3 widzimy przecina tutaj

tak. A PST1 przecina tutaj między A i G

i tutaj między A i G. A hint 3 też tutaj

przecina. Oczywiście

powstają nam takie oto lepkie końce w

DNA. I teraz ten jeden oligonukleotydyt

już może się tutaj wcisnąć. Zauważcie,

że on ma AGCT na początku,

a więc w tej nici 5 prim 3 prim, on

będzie mógł tutaj utworzyć wiązania

wodorowe AGCT.

I podobnie tutaj na końcu 3 prim. Mamy

ACGT

ACGT, tak więc on tutaj może się

wcisnąć. Wpis wpiszmy go zatem tutaj. No

a sekwencja tego drugiego

oligonukleotydu to będzie po prostu ta

sekwencja, której tutaj brakuje. Czyli

po prostu możemy sobie ją dopisać,

tak? I to co jeszcze musimy zrobić to

pamiętajmy o tym, że musimy ją wpisać w

orientacji 5 prim 3 prim, czyli od tego

końca do tego końca. No i to wystarczy

po prostu obrócić i mamy gotową

odpowiedź. Ja teraz postaram się wam

pokazać jak to zrobić bez takiego

pisania na kartce, tylko też żeby to

zrobić w apie. Przenosimy się do AP.

Dobra, jesteśmy już w apie. Mamy podaną

sekwencję naszego oligonukleotydu. No

ale musimy na początku wziąć plazmid,

gdzie chcemy wstawić, w który chcemy

wstawić ten oligonukleotyt.

To znaczy chcemy wstawić hybrydę

oligonukleotydów. No ale wiecie o co mi

chodzi. przepraszam te skróty myślowe.

Więc wybieramy sobie w apie gen

znaczy plik, który jest związany właśnie

z plazmidem.

Otwieramy go i teraz wiemy, że

przecinamy go hint 3 i PST1, więc

zaznaczmy sobie te miejsca na początku

może w tymże plazmidzie.

Dobra, zaznaczamy hint 3 pst1 i klikamy

highlight. O, akurat byłem w tym oknie,

gdzie były te enzymy. No i widzimy to,

co to samo, co widzimy tutaj w treści

zadania. Tak, to jest ten dokładnie

fragment, który tutaj jest

przedstawiony.

Dokładniej zaczyna się tutaj od tego

TGC.

I tutaj widzimy, że no tak jak

mówiliśmy, będziemy mieli przecięcie

tutaj i będziemy mieli przecięcie tutaj.

Ale żeby zobaczyć dokładnie gdzie

będziemy mieli przecięcie, jeśli nie

mamy dostępu do załącznika 1, to teraz

zamiast podświetlać tylko te miejsca

możemy po prostu przeprowadzić

przeprowadzić trawienie. Znów klikamy

sobie enzyme selection i możemy kliknąć

digest.

Dobra, digest, czyli trawić. No i teraz

co nam powstało? Powstały nam takie trzy

sekcje.

Powstała nam sekcja, która się zaczyna

od startu i aż do miejsca rozpoznawanego

przez hint 3. Tutaj możemy ją sobie

zaznaczyć klikając na nią. Możemy sobie

zaznaczyć też część od Hint 3 do PST1,

czyli ta, która została wycięta. Możemy

ją tak traktować.

No i mamy jeszcze sekwencję od PST1 do

samego końca.

Nas teraz tak naprawdę będzie

interesowało, co my chcemy wziąć

sekwencję od startu do hint 3, później

wstawić nasz oligonukleotydyt, a później

wstawić tą część do samego końca. Więc

weźmy sobie otwórzmy nowy plik,

zapiszmy go jako załóżmy

plazmit

z

wstawką.

Okej. I teraz tak, będziemy sobie po

prostu

kopiować.

Uporządkujmy najpierw swoje miejsce

pracy i będziemy po prostu kopiować te

rzeczy. Czyli mamy tak start hint 3.

Klikamy copi, klikamy paste. Okej.

Yyy, widzimy, że nam się poprawnie to

zaznaczyło, to znaczy do tego pierwszego

a też zostało to skopiowane.

Teraz wstawiamy

nasz oligonukleotydyt.

Okej, wstawiliśmy.

Sprawdzamy czy się wszystko dobrze

wstawiło. Wydaje się, że tak. i

wstawiamy pozostałe

pozostałą część plazmidu. Oj,

przepraszam. Hops.

Copi

i paste.

Dobra.

I widzimy, że zostały odtworzone miejsca

w tym nowym plazmidzie. Odtworzone

miejsca rozpoznawane przez Hint 3 i

PST1. To nas na razie nie interesuje.

Nas na razie interesuje jaką sekwencję

ma ten nasz drugi oligonukleotyt.

I teraz tak, tu widzimy

ten oligonukleotyt, który jest tutaj.

Tak. I teraz wiemy, że hint 3 on

przecina tutaj tak mamy pokazane tym

nawet, nie wiem czy to widać, ale tutaj

tymi czarnymi takimi dziubkami zostają

pokazane miejsca gdzie te enzymy

przecinają tą sekwencję. Więc to co jest

tutaj

pomiędzy tymi dziubkami to jest ta

sekwencja drugiego oligonukleotydu.

No to skopiujmy ją sobie.

Pamiętajmy, że ona jest tutaj z tego od

tego końca do tego końca, bo mamy ją

podać od 5 do 3 prim. Więc tak naprawdę

możemy albo zrobić copi i później ją

obrócić, zrobić to reverse complement,

odwrotnie komplementarną sekwencję, albo

od razu zrobić copy reverse complement,

zrobić nowy plik.

Okej,

zapiszemy sobie go jako

drugi oligonukleotydyt.

I to jest odpowiedź do tego zadania. To

co, chyba czas wrócić do prezentacji.

Dobra, no to jesteśmy już z powrotem w

prezentacji. Przejdźmy do zadania 13. W

pliku NC012920GB

w formacie Ginbank znajduje się pełna

sekwencja mitochondrialnego DNA.

Przeanalizuj ją w programie AP i znajdź

gen Trna Pro. Możesz to zrobić na dwa

sposoby. Na razie pominę te sposoby. My

sobie je przeczytamy już jak będziemy to

robić.

Zrobimy i ten, i ten sposób.

Jeśli jest taka potrzeba, użyj funkcji

dostępnych w w menu edit. Cut, copy,

paste. Wytnij, copiuj, wklej. I to to co

już robiliśmy poprzednio, czyli cut

refcom, copy refcom i paste refc.

Wytnij, kopiuj, wklej, ale robią tą

jednocześnie odwrotn odwrotnie

komplementarną sekwencję. Tak. No i to

jest to już tutaj napisane. Reverse

complemento funkcja, która zmieni

zaznaczoną sekwencję na odwrotnie

komplementarną. I mamy podać sekwencję

genu trna pro w orientacji 5 prim do 3

prim w odpowiednie miejsce w pliku

odpowiedzi txt. No to wracamy do AP.

Dobra, to jesteśmy znowu w apie i teraz

taka dla was rada. Zapisujcie sobie

wszystkie pliki z poprzednich zadań.

Nigdy nie wiecie, co wam się może

przydać, więc ja sobie to na razie

zamknę.

To sobie też zamknę i chcę zapisać

zmiany. Pełc 18 na razie może jeszcze

chyba chociaż.

Dobra, na razie po prostu sobie otwórzmy

ten plik NC 0129

20 GB.

Okej, to teraz sobie zamkniemy. Po

prostu nie chciałem, żeby mi się AP

zamknął całkowicie.

Dobra. I tak jak mówiłem, to

widzieliście w pliku Fasta mamy po

prostu sekwencję. W pliku Ginbank mamy

już dodatkowe informacje. Mamy jakieś

pętle D. Yyy, mamy, to jest yyy z tego

co pamiętam mitochondrialne DNA. No to

mamy jakieś małe yyy rna, mamy y jakieś

informacje gdzie leży tna y który

przenosi walinę. My chcemy znaleźć tna,

który przenosi prolinę. No i autorzy

tego arkusza dosłownie mówią nam jak to

zrobić. W głównym oknie, w którym nad

sekwencją nukleotydową znajduje się

lista annotacji w kolumnie feature,

czyli tutaj znajdź te rena pro w

kolumnie direction, tutaj jest ta

kolumna, sorki, ją troszeczkę powiększę,

jest wskazany kierunek. Większe niż

oznacza, że element ten jest

zlokalizowany w orientacji 5 prim, 3

prim, a mniejsze niż oznacza, że ten

element leży w odwrotnej orientacji. A w

kolumnie location są wskazane pozycje

resztutydowych odpowiadających genowi

terena pro. No dobra, no to sobie

znajdźmy te Arena Pro. Scrolluję,

scrolluję, scrolluję.

O, jest to pro. Klikamy i podświetla nam

się od razu ta sekwencja. Widzimy, że

jest ona w tej orientacji mniejsze niż,

czyli w tej odwrotnej orientacji, a my

musimy podać, przepraszam, tutaj

orientacja 5 prim 3 prim, czyli musimy

zrobić copi refom, nowy plik, tworzymy

nowe pliki, nie boimy się tego

i mamy

możemy to zapisać

trna pro. Okej. Yyy i możemy to na razie

sobie jeszcze yyy może zminimalizować.

Natomiast zróbmy teraz też ten drugi yyy

drugi sposób, żeby to znaleźć. Mamy

jeszcze manyu features, list features.

Zobaczmy.

Czekajcie, muszę tutaj troszeczkę

zmniejszyć to okno, żeby się zmieściło w

moim monitorze.

Tak. No i teraz mamy w kolumnie name

znaleźć terena pro.

Ono jest gdzieś na końcu, więc sobie

przeskrollujmy. Tak. Terena Pro.

Widzimy, że w kolumnie location, czyli w

tej kolumnie ostatniej, upewnijmy się,

tak? Ostatnia kolumna to jest kolumna

location. Mamy informację, że jest to

RF, czyli leży w odwrotnej orientacji.

Klikamy na to, możemy to zamknąć. W tym

momencie podświetliło nam się to, co

wcześniej i zrobilibyśmy to samo, czyli

copy refcom i wklejamy do nowego pliku.

yyy tak jak zrobiłem to przed chwilą.

Więc to jest całe zadanie yyy 13

i przechodzimy do prezentacji.

Dobra, czyli mamy tutaj odpowiedź, którą

też macie w opisie. I teraz

projektowanie starterów. Zaprojektuj

startery, które umożliwią amplifikację

genuż

ze starterów będzie zawierać trzy

elementy. W kolejności od końca 5 prim

do końca 3 prim. Sekwencje Agata, dzięki

której miejsce rozpoznawane przez enzym

restrykcyjny nie będzie położone

bezpośrednio przy końcu startera.

Sekwencję rozpoznawa rozpozawaną tu

literówka przez enzym restrykcyjny i

sekwencję hybrydyzującą z matrycowym

DNA. Tak zwany lewy starter w całości ze

wszystkimi wymienionymi powyżej

elementami musi mieć długość 35

nukleotydów, a na jego końcu 3 prim musi

być cytozyna.

Okej. Mamy pewne dość standardowe jak na

olimpiadę biologiczną warunki, ale tutaj

mamy bardzo ścisły warunek jeśli chodzi

o ten lewy starter. 35 nukleotydów na

końcu 3 prim cytozyna. Podaj sekwencje

części hybrydyzującej z matrycowym DNA

lewego startera. Sekwencję wklej w

orientacji 5 prim 3 prim w odpowiednie

miejsce w pliku odpowiedzi txt.

I kolejne zadanie 1.5 odnośnie prawego

startera. Takie samo część hybrydyzująca

z matrycowym DNA. Y i tutaj mamy tylko

taki disclaimer. Różnica temperatur

topnienia części hybrydyzującej z

matrycowym DNA lewego i prawego startera

nie może być większa niż pół stopnia.

Temperaturę topnienia należy określić w

głównym oknie programu AP pod

oznaczeniem TM wyświetla się temperatura

topnienia sekwencji, która jest

zaznaczona. Starter prawy też musi mieć

na końcu 3 prim resztę nukleotydową C

albo G. Czyli tutaj w lewym C, a w

prawym C albo G. Słuchajcie, tu jeszcze

przedstawiłem wam jak teraz wygląda

sytuacja. Tak lokalnie mamy wstawkę z

promotorem,

mamy zaraz za tym PST1,

no i tutaj będziemy chcieli wstawić nasz

w tym zaraz za tą wstawką będziemy

chcieli wstawić gen TNA Pro. Natomiast w

tym momencie bierzemy się wyłącznie za

tą część hybrydyzującą z matrycowym DNA

lewego i prawego startera. Więc

przechodzimy znowu do APA. Dobra,

słuchajcie, to tak. Ja bym sobie w tym

momencie zamknął to. Okej, tu

przepraszam, muszę się troszeczkę

wygimnastykować, żeby zauważyć, co jest

na dole mojego monitora. Jakoś za bardzo

sobie przysunąłem tutaj laptop, który

leży przede mną i mi zasłania część

monitora. Dobra, mamy Gent Arena Pro,

który będziemy chcieli,

który będziemy chcieli amplifikować.

No więc teraz tak na na początku to

sobie w ogóle usunę ten feater, bo mnie

to wkurza troszeczkę. Chcę mieć po

prostu sekwencję, która jest w ten

sposób pokazana.

Zacznijmy od startera lewego, czyli od

1.4. Starter lewy musi mieć długość 35

nukleotydów.

I

co wiemy? Wiemy, że musi mieć yyy

sekwencję Agata na początku, czyli pięć

nukleotydów, sekwencję rozpoznawaną

przez enzym restrykcyjny. No niezależnie

od tego, który enzym użyjemy,

przepraszam, gdzie to było? Tutaj

my użyjemy PST1, to co wam pokazywałem

przed chwilą na slajdzie, bo on leży tuż

za wstawką, ale niezależnie który byśmy

wzięli, to one wszystkie mają po sześć

nukleotydów długości, te miejsca

restrykcyjne dla tych enzymów. Więc

odchodzi nam kolejne sześć, czyli 11

nukleotydów od całego lewego startera,

czyli sama część, która hybrydyzuje z

matrycowym DNA będzie miała długość 30,

przepraszam, 24 nukleotydów, tak? 35-

11. No więc zaznaczmy sobie 24

nukleotydy w tym lewym starterze.

Widzimy, że nasza odpowiedź jest

najprawdopodobniej

poprawna, no bo na końcu mamy

nukleotydyt C, a na jego końcu 3 prim

musi być cytozyna, więc chyba się to

wszystko zgadza. Możemy sobie to

skopiować

w takim razie, utworzyć nowy plik,

wkleić tą sekwencję tutaj i nazwać ją

lewy

starter. To oczywiście nie jest jeszcze

kompletny starter, ale ten plik będziemy

modyfikować w taki sposób, żeby ten

starter utworzyć. No i to jest odpowiedź

do zadania 14, tak? Czyli to jest ten ta

część hybrydyzująca z matrycowym DNA

lewego startera. Teraz jeśli chodzi o

ten starter, jeśli chodzi o ten starter

prawy, no to co my wiemy? My wiemy, że

on musi mieć temperaturę topnienia,

która jest nie większa. Nie może być

większa niż ta ta różnica nie może być

większa w temperaturze topnienia między

lewą częścią hybrydyzującą z matrycowym

DNA lewego i prawego startera niż pół

stopnia. Dodatkowo musi być na końcu 3

prim reszta C lub G.

Dobra, widzimy tutaj temperaturę

topnienia lewego startera, która wynosi

46,7 stopnia. No to jedźmy sobie, aż nie

będziemy mieli tej różnicy takiej

właśnie w tej w tym zakresie półstopnia.

Okej, jeszcze trochę. O, no i tutaj mamy

idealny idealnego kandydata, bo mamy na

końcu 3 prim tutaj resztę C, tak? No i

mamy temperaturę topnienia, która różni

się wyłącznie 0,4 stopnia Celjusza. I

teraz uwaga, to jest prawy starter, więc

musimy wziąć sekwencję odwrotnie

komplementarną, tak? Czyli będziemy

mieli copi refom,

znów nowy plik, wklejamy,

zapisujemy

i zapisujemy jako prawy starter.

Okej. No i to są to jest odpowiedź do

zadania 1.5. To jest odpowiedź do

zadania 14.

To co, teraz wracamy do arkusza i

zobaczymy, co dalej z tymi starterami

musimy zrobić. Okej, jesteśmy z powrotem

na prezentacji. Tu mamy odpowiedzi,

które przed chwilą widzieliście w APIE.

I teraz tak. Wybierz dwa różne enzymy

restrykcyjne, które będą użyte do

przecięcia zarówno wektora zawierającego

promotor T7, jak i produktu PCR. Wybrana

para enzymów restrykcyjnych musi mieć

wydajność trawienia 100% w jednym

buforze.

No i mamy określić ten bufor, w którym

produkt PCR zamplifikowany Gentyrena Pro

będzie poddany trawieniu enzymami

restrykcyjnymi. W odpowiednie miejsce w

pliku odpowiedzi TXT wpisz oznaczenie

literowe buforu A, B, C albo D.

Nasza wstawka z promotorem T7 leży tutaj

przed PST1, więc super byłoby tutaj

przeciąć to PST1

i najbliżej jest BAM H1, więc sprawdźmy,

czy to BAM H1 da się również w tym samym

buforze co PST1

użyć. No i mamy bam H1 PST1.

No i widzimy, że w buforze C mamy po

stówce, więc to co tutaj było napisane,

czyli ta wybrana para enzymów musi mieć

wydajność trawienia 100%. W jednym

buforze to jest zachowane, więc chyba

najlepiej będzie po prostu wybrać bufor

C. I wybór buforu C wiąże się też, że z

wyborem PST1 i BAMH1 jako tych enzymów

restrykcyjnych, które będziemy teraz

używać i których miejsca restrykcyjne

będziemy wprowadzać do naszych

starterów. Więc odpowiedź C, jeśli

chodzi o to pytanie.

No właśnie. I teraz mamy podać sekwencję

całego lewego startera od 5 do 3 prim i

sekwencję całego prawego startera też 5

prim do 3 prim. W sekwencji lewego

startera będziemy musieli dodać

sekwencję Agata oraz sekwencję y, która

jest rozpoznawana przez enzym PST1.

Natomiast do prawego startera również

Agata na początek, a później

Bamh1, dobrze pamiętam BAM H1. Więc no

cóż, przechodzimy do APA. Dobra,

jesteśmy w APE. Mamy 1718

i pamiętajmy, co mamy zrobić. Agata i

dodać jeszcze sekwencję rozpoznawaną

przez enzym restrykcyjny. Lewy starter

będzie miał na początku Agata, a później

sekwencję rozpoznawaną przez PST1.

Zobaczmy jaka to jest ta sekwencja

rozpoznawana przez PST1. Widzimy ją

tutaj. To jest C T

G.

Okej. No i na początku Agata.

Zaś jeśli chodzi o prawy starter

będziemy mieć bam H1, czyli GG A T CC

i na początek Agata.

I to jest kompletna sekwencja lewego

startera. To jest kompletna sekwencja

prawego startera i to są odpowiedzi

odpowiednio na zadanie 17 i 1 17 lewy

starter, 18 prawy starter. No cóż,

wracamy do prezentacji. Dobra, jesteśmy

z powrotem. Tu są odpowiedzi, które

przed chwilą też widzieliście w API i

zadanie 1. Lokalizacja antykodonu. Kodon

kodujący prolinę w kodzie genetycznym w

mitochondrium człowieka to 5 prim CCA3

prim. Określalizację antykodonu w

obrębie cząsteczki terena prolinowego. W

odpowiednie miejsce w pliku odpowiedzi

txt wpisz pozycję pierwszej reszty

nukleotydowej antykodonu, stosując

wyłącznie cyfry arabskie.

No to słuchajcie, może teraz nie będę

nic tłumaczył, ale przejdziemy od razu

do APA i pokażę wam jak to powiedzieć.

Dobra, jesteśmy już w APIE. Yyy, lewy

starter i prawy starter na razie możemy

sobie pozamykać zapisując zmiany, jak y

by chcieli nas od nas jeszcze coś y z

tymi starterami później. Yyy, mamy tak

określić lokalizację yyy antykodonu w

obrębie cząsteczki TRNA Pro dogo yyy

kodonu. No skoro kodon ma 5 prim CCA 3

prim, to my musimy pamiętając, że to

jest od 5 do 3 prim, znaleźć jaką

sekwencję? No musimy znaleźć sekwencję

TGG,

więc znajdźmy sobie taką sekwencję.

Ctrol F, TGG,

Find Next. No i widzimy tutaj, że mamy

taki faktycznie

antykodon i mamy podać

pierwszą resztę nukleotydową, znaczy

pozycję pierwszej reszty nukleotydowej,

przepraszam bardzo, tego antykodonu i

widzimy, że jest to 32, więc taka jest

odpowiedź na to pytanie. Wracamy do

prezentacji. Okej, więc tak jak

mówiliśmy, jest to 32 i zadanie 11.

Enzym TRM5 jest kodowany przez gen TRMT5

zlokalizowany na chromosomie 14 i mamy

porównać sekwencję nukleotydową genu z

sekwencją nukleotydową dojrzałego mRNA.

I mamy przygotowanie przyrównania

sekwencji.

To za chwilę zobaczymy sobie w samym

apie.

I mamy podać liczbę eksonów genu trmt i

zapisać odpowiedź w odpowiednim miejscu

w pliku odpowiedzi txt, stosując

wyłącznie cyfry arabskie. Czyli co my tu

robimy? My bierzemy gen, bierzemy mRNA,

przyrównujemy te sekwencje do siebie i

tam gdzie będą przyrównane, tam gdzie

będziemy mieli identyczność sekwencji,

będziemy mieli do czynienia po prostu

zsonami, bo one zostały wyłącznie w mRNA

po procesie splicingu. Więc teraz

przejdziemy do Ape i zrobimy to

przyrównanie i pokażę wam jak te Oony

zobaczyć na tym przyrównaniu. Dobra,

jesteśmy już w apie. Musimy teraz tak,

musimy otworzyć. Przepraszam, jesteśmy

gdzie my jesteśmy? Jesteśmy tu. Tutaj.

Tak.

Musimy otworzyć sekwencję nukleotydową

genu

to było, pamiętajcie, pamiętacie to NG

od Gin.

Okej. Też myślę, że możemy sobie te Rena

Pro zamknąć na razie i zapisać zmiany.

Okej. NG. No i jeszcze sekwencja

mRNA

tego

tego genu, czyli nm.

Okej, mamy otwarte te dwie sekwencje. No

i teraz robimy to, co tutaj nam każą.

Czyli tak, otworzyliśmy już pliki fasta

w programie Ape. Klikamy Tools Align

Sequences. Przyrównaj sekwencje.

A chyba kliknąłem coś innego. Sorki.

Tak. Align sequences.

Dobra. I teraz tak. Jako sekwencję

referencyjną wybieramy gen

w reference reference sequence.

Natomiast sekwencje dojrzałego mrna w

części align to Windows, czyli tylko te

sekwencje wybieramy. Tu mi się coś

ucięło, więc zobaczcie, tu jeszcze jest

OK i cancel.

I cóż, klikamy po prostu okej. Mamy

domyślne ustawienia i powinno nam się

stworzyć przyrównanie.

I to przyrównanie się mi otwiera w

zupełnie innym części mojego monitora,

więc muszę je, przepraszam, tutaj

sorry, muszę je w jakiś sposób dla was

dopasować.

U was powinno być lepiej. To widoczne,

sorry. Postaram się to zrobić

szybciutko.

Hops, hops. Okej,

dobra. I mamy przyrównanie. Mamy

sekwencję naszego genu. To była

sekwencja referencyjna. Ona jest na

górze.

Na dole jest yyy pokazana tylda, czyli

że żadnego trafienia nie mamy. Yyy tu

kiedy będziemy mieli do czynienia z

identycznością, będą po prostu też

nukleotydy. No to szukamy takich miejsc,

gdzie te nukleotydy są.

Nie ma, nie ma, nie ma, nie ma, nie ma,

nie ma. O, proszę bardzo. Jest pierwsze

takie miejsce. Ono jest też oflankowane

czerwonymi takimi

czerwonymi polami, więc łatwo jest je

znajdywać wizualnie, kiedy tak szybko

scrollujemy przez przyrównanie. Więc tu

mamy do czynienia z pierwszym eksonem.

O, następny ekson. Tak, następny ekson.

Drugi, trzeci,

czwarty i piąty.

Bardzo długi. Piąty on

okej. Więc mamy do czynienia z pięcioma

eksonami i to jest odpowiedź na to

zadanie. Wracamy do prezentacji. Tak

więc tak jak przed chwilą sprawdziliśmy,

mamy odpowiedź pięć i ostatnie dwa

zadania. Znajdowanie lokalizacji

kodonów. Długi wstęp. Białko TRM5 ma

masę około 58 kg daltonów i składa się z

509 reszt aminokwas. Wykazano, że

substytucja arg 291 HIS zmieniająca

arginy na hisyne w pozycji 291,

przepraszam, już nie mam siły mówić 291

sekwencji aminokwasej TRM5 znacznie

obniża aktywność katalityczną tego

enzymu. I mamy podane instrukcje

odnośnie znajdowania otwartej ramki

odczytu i translacji insilico.

Sobie zaraz to wszystko zobaczymy. I

jeszcze wyświetlanie tabeli kodu

genetycznego. Zadanie1 brzmi: "Okry

lokalizację kodonu kodującego Argininę

291 w sekwencji mRNA genu trmt w

odpowiednie miejsce w pliku odpowiedzi

txt wpisz pozycję pierwszej reszty

nukleotydowej tego godonu stosując

wyłącznie cyfry arabskie a następnie

mamy określić pozycję kodonu właśnie

tego, które która uległa mutacji

skutkującej substytucjom arc 2 291 HIS i

też w odpowiednie miejsce w pliku

odpowiedzi txt mamy wpisać pozycję w

kodonie pierwszą drugą lub trzecią

właśnie, która uległa tej mutacji.

Słuchajcie, lecimy do arkusza. Dobra,

jesteśmy już w arkuszu i teraz tak

przechodzimy sobie do do tego białka

TRM5.

Dobra, więc mamy określić lokalizację

kodonu kodującego Arginę 291 w w

sekwencji mRNA genu czyli zostawiamy

sobie wyłącznie sekwencję

mRNA NM. Tak.

I teraz tak na początku, żeby dowiedzieć

się gdzie jest ta arginina, to musimy

przeprowadzić translację otwartej ramki

odczytu. A więc musimy znaleźć na

początku otwartą ramkę odczytu.

Otworzyliśmy już plik fasta w programie

AP. Klikamy ORFS find next. Tutaj jest

też skrót klawiszowy, którym ja się będę

posługiwał. Na początku kliknę

i teraz tak. Mamy przyjąć, że najdłuższa

otwarta ramka odczytu spośród

znalezionych to jest ta, która ulega

translacji. Ta ma 1530.

Tutaj mamy długość pokazaną. No to

szukamy dalej. 1410.

Pamiętajmy, że tamta miała około 1500.

No nie widzę nic dłuższego. Już

dochodzimy do końca pliku.

Więc chyba tak. 1530 nasza najdłuższa

ramka odczytu. Teraz przeprowadzimy

translację Insilico. Mamy zaznaczyć

myszką część sekwencji wyświetlonej w

programie AP, która ma być poddana

translację Insilico. Już to jest

zrobione, jest podświetlona. Klikamy

ORFS translate.

Okej.

I teraz tak. Chcemy przeprowadzić

translację

tylko jeśli chodzi o to, co jest

zaznaczone. Używamy jednoliterowego

kodu jeśli chodzi o aminokwasy.

I teraz tak, chcemy na pewno, żeby DNA

było wyświetlane. Dlaczego? Dlatego, że

w tym zadaniu mamy podać lokalizację

kodonu kodującego arginę 291.

Jeżeli byśmy przeprowadzili translację i

dostalibyśmy samą sekwencję aminokwasą,

nie mielibyśmy zielonego pojęcia,

gdzie w DNA, znaczy w naszym przypadku

tym mRNA, przepraszam bardzo, znajduje

się kodon, który odpowiada tejże właśnie

reszcie aminokwas. A tak w ten sposób

będziemy widzieć arginina i pod spodem

kodon. Więc przeprowadźmy sobie taką

translację.

No i tak jak mówiłem, widzicie, że mamy

taką sytuację, że

że mamy pod spodem pod aminokwasami

kodony, które im odpowiadają.

I szukamy sobie teraz arginy 291.

Mamy tą arginę tutaj

tak na oko, nie? 281, no to pewnie

gdzieś tutaj 291. No akurat arginina to

jest R, więc

to na pewno ta. I mamy kodon CGT. I

teraz jak sobie klikniemy w ten kodon

CGT.

To widzicie teraz co się dzieje w oknie

tutaj po prawej stronie, że zaznaczają

nam się te nukleotydy w naszym mRNA,

które przeprowadza, w którym

przeprowadzaliśmy translację.

No i akurat kliknąłem sobie tą możemy

sobie w ogóle zaznaczyć chyba cały ten

fragment.

A już chyba nie będę kombinował.

Można tak zaznaczać? chyba nie. Dobra,

ale my klikamy pierwsze C tego kodonu i

widzimy,

że ono się zaczyna w 977 pozycji i to

jest odpowiedź na to pytanie 977

pozycja. Tutaj jeszcze jest uwaga,

żebyśmy się upewnili, że wybrany kod

genetyczny to the standard code. To ja

sobie to jeszcze się upewnię z wami.

Preferences.

Okej. Oczywiście w jakimś dziwnym

miejscu się otworzyło

i teraz tak, analysis i mamy the

standard code, więc wszystko się zgadza.

Dobra. I teraz

co my mamy dalej? Mamy powiedzieć, tutaj

mamy ten kodon. Przypominam,

mamy powiedzieć pozycję kodonu, która

uległa mutacji skutkującej substytucją

Arc 291 HIS.

Czyli po prostu musimy zobaczyć jaka,

jaki który nukleotydyt w tym kodonie

uległ mutacji

dając zamiast arginy histydnę, czyli po

prostu kodon kodujący argininę zmienił

się w kodon kodujący histę. Więc

zobaczmy sobie w takim razie help

standard genetic code.

Okej, muszę to chyba znowu jakoś

wygrzebać z odmentętów mojego

yyy odmętów mojego monitora.

Dobra. No i mamy CGT. Wiemy, że to

koduje Arginę. Zobaczmy, co koduje

histdynę. Mamy CAT i CAC. Yyy, no i

słuchajcie, widzimy, że yyy tutaj mamy

do czynienia po prostu z zwykłą

substytucją, jeśli chodzi o yyy, o

nukleotydyt drugi w kodonie, zamiast G

mamy A. Więc odpowiedzią na to pytanie

jest po prostu liczba 2. To jest ta

pozycja kodonu, która ulega

uległa mutacji dając właśnie ten fenotyp

AR 291

His. No i słuchajcie, to jest cały

arkusz, jeśli chodzi o bioinformatykę z

roku 2025. Jeśli macie jakiekolwiek

pytania, zachęcam do zadawania ich w

komentarzach. Dziękuję za każde

polubienie, subskrypcję oraz komentarz

pod tym filmem, ponieważ troszeczkę

pracy w te olimpijskie

materiały muszę włożyć. Mam nadzieję, że

się podobało.